PRACTICA 9: DETERMINACION DE RUBEOLA MEDIANTE ELISSA

PRACTICA NUMERO 9.

5/03/2018

OBJETIVOS:

El enzimoinmunoalasis Rubella Virus IgG ELISA se utiliza para la determinacion cuantitativa de anticuerpos IgG especificos contra Rubella Virus en suero o plasma humano.

La avidez de Rubella IgG puede ser determinada con un tipo de ensayo.

UTILIDAD CLINICA:

El Rubellavirus es un virus de ARN con envoltura de cadena que pertenece al grupo de los Togavirus. Tiene forma esférica y un diámetro de 50 a 70 nm.

Son patógenos de las vias respiratorias y se transmite mediante las gotas contaminadas de saliva. Es una enfermedad contagiosa que cuando ocurre en el embarazo presenta un riesgo severo de daño al feto.

FUNDAMENTOS:

La determinación inmunoenzimática cuantitativa de anticuerpos específicos contra Rubellavirus se basa en la técnica del ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay: ‘ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas’).Las tiras de micropocillos que se usan como fase sólida están recubiertas con antígenos específicos del Rubellavirus inactivado (toxoides). Los anticuerpos existentes en la muestra se unen a los antígenos inmovilizados de la placa de microtitulación. El conjugado de anticuerpos IgG anti humano con peroxidasa de rábano, se une con los complejos antígeno-anticuerpo en muestras positivas.Estos complejos inmunológicos desarrollan una coloración azul después de incubarlos con sustrato de tetrametilbenzidina (TMB). Finalmente se añade ácido sulfúrico para detener la reacción, causando un cambio de coloración de azul a amarillo. La densidad óptica se mide con un lector de ELISA a 450 nm.

APARATAJE:

Fotometro

MATERIALES:

• Tubos de plástico y gradillas
• Pipetas y puntas
• Agua destilada

REACTIVOS:

• Microtiras (IgG) recubiertas de antígeno de Rubellavirus
• Diluyente para IgG de la muestra, que será el tampón
• Solución de parada
• Solución de lavado
• Suero o plasma citratado
• Conjugado IgG anti-humano (Rubellavirus)
• Solución de sustrato de TMB
• Rubellavirus IgG Standars (0,10,50 y 100 IU/ml)

PROCEDIMIENTO:

           Lo primero que hay que hacer es diluir la muestra, para ello pondremos 10 microlitros de la muesstra con 1 ml de tampón,mezclándolo bien con el vortex.

1. A continuación pipeteamos 100 μl de estandares y muestras en los pocillos respectivos. Dejaremos el A1 para el blanco.
2. Recubrimos las tiras con los autoadhesivos suministrados
3. Incubamos 1h a 37ºC
4. Después de la incubación, desechamos el contenido de los pocillos y lavamos la placa tres veces con 300 μl de solución de lavado.
5. Pipeteamos 100 μl de conjugado anti-IgG (Rubellavirus) en cada pocillo con excepción del blanco. Cubrimos con una lámina adhesiva.
6. Incubamos 30 min a temperatura ambiente. Evitar la luz solar directa
7. Repetimos el lavado como el paso anterior.
8. Pipeteamos 100 μl de sustrato de TMB en todos los pocillos.
9. Incubamos exactamente 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente
10. Pipeteamos en todos los pocillos 100 μl de la solución de parada en el mismo orden y mismo intervalo de tiempo  como con el sustrato de TMB. Toda coloración azul formada durante la incubación se convierte en amarilla.
11. Por último medimos la extinción de la solución en cada pocillo a 450 nm en un periodo de 30 min después de añadir la solución de parada.

RESULTADOS:

Al no poder tener tiempo para acabar la practica no hemos podido obtener resultado.